正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化 物和羟化物等,研究表明,机体 95%以上的活性氧(ROS)都来自于线粒体,其失衡所致 的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。
正常情况下,细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态,细胞内活性氧(ROS) 水平维持在较低的生理范围;在病理情况下, 细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破, 细胞内活性氧水平过多, 就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸, 使机体出现氧化应激,同时, 活性氧还可攻击线粒体 DNA 产生氧化损伤, 导致线粒体 ATP 合成减少、线粒体膜电位破坏 等结构和功能变化。
因此, 通过检测活性氧的变化来判断线粒体的功能是否正常具有重要意义。 测定原理:
荧光探针-还原型二氯荧光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可扩散通 过线粒体膜, 在线粒体内被酯酶水解, 形成无荧光的 DCFH ,DCFH 迅速与 ROS 反应生成 荧光物—氧化型二氯荧光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF) 。 根据上述原理设计了利用荧光 法直接定量检测线粒体 ROS 产生速率的方法。将荧光强度随时间变化的数据点拟合, 线性
回归直线斜率与 ROS 产生的速率呈正比。
需自备的仪器和用品:
多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体 120 mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:液体 50 mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂三:液体 1.5 mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存; 临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解;
试剂五:粉剂×1瓶,4℃保存; 临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解;
试剂六:粉剂×1瓶,4℃保存; 临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解;
试剂七:液体×1瓶, 避光-20℃保存;临用前用试剂二稀释 300 倍后使用; 线粒体提取:
1、准确称取 0. 1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三, 用冰浴匀浆器 或研钵匀浆。
2 、将上述匀浆液于 600g (离心率),4℃离心 5min。
3、弃沉淀, 将上清液移至另一离心管中,11000g ,4℃离心 10min。
4 、弃上清, 沉淀中加入 200μL 试剂二重悬。 测定步骤:
1、 多功能酶标仪预热 30min 以上, 调节激发光 499nm ,发射光 521nm。
2. 在黑色不透光 96 孔板中加入下列试剂
试剂名称(μL) |
测定管 |
空白管 |
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线粒体悬液 |
20 |
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试剂二 |
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20 |
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试剂四 |
50 |
50 |
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试剂五 |
50 |
50 |
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试剂六 |
50 |
50 |
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试剂七 |
30 |
30 |
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混匀, 37℃避光孵育 15min。 |
孵育完成后,在 37℃恒温下测定 10min 内荧光强度,激发波长 499nm,发射波长 521nm, 记录 10min 内的荧光值变化。
ROS 产生速率计算:
对采样数据点即荧光强度随时间的变化进行线性回归拟合处理 ,计算出回归系数, 即直线斜 率 (k)。实际线粒体 ROS 产生速率等于样本荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜 率(k 测定)减去本底荧光强度随时间变的数据点线性回归直线斜率 (k 空白)。
(1)按样本鲜重计算:每 g 组织线粒体每秒钟荧光单位的变化, 即 u/ s/g 鲜重
ROS 产生速率(u/ s/g 鲜重)=(k 测定-k 空白)/(V 样÷V 总×W) =10×(k 测定-k 空白)÷W
(2)按样本蛋白浓度计算:每毫克蛋白线粒体每秒钟荧光单位的变化 u/ s/mg prot。
ROS 产生速率(u/ s/ mg prot)=(k 测定-k 空白)/(V 样÷V 总×Cpr) =10×(k 测定-k 空白)÷Cpr
V 样:加入样本体积, 0.02 mL;V 样总: 悬液体积, 0.2 mL;W: 样本鲜重, g;Cpr: 样本 蛋白浓度,mg/mL。